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Méthodes
Fort de nos compétences et de notre expertise, nous réalisons ces analyses par différentes techniques de Biologie Moléculaire. Le tableau suivant résume la technique en fonction de l'analyse :
Matrices analytiques :
Nos techniques d'extraction/purification d'ADN nous permettent de travailler de manière adaptée sur diverses matrices :
- Matières premières végétales (grains, feuilles, racines,...)
- Produits transformés d'origine végétale (tourteaux, farines,...)
- Produits finis (purées, ketchup,...)
- Produits carnés (viandes fraiches, cuites ou congelés)
- Produits de la mer (poissons)
- Matières liquides
- Matières huileuses
- Ecouvillons et lingettes
- Farines et alimentation animales
- ...
Il est important de noter qu'un préalable à la réalisation de ces analyses est la présence d'ADN non dégradé (ou tout au plus faiblement). Certains process de fabrication entraînent en effet une trop forte dégradation des ADN rendant impossible toute analyse.
Certaines matrices (ex : huiles non raffinées,...) nécessitent une étape de purification supplémentaire afin de pouvoir analyser les ADN dans les meilleures conditions possible.
Enfin, selon la nature de l'échantillon, sa composition et les traitements subis, l'ADN extrait peut contenir après purification des inhibiteurs de PCR (ex : polyphénols, alcools,...). Les inhibitions de la PCR peuvent être partielles (sous-estimation lors de la quantification et augmentation de la limite de détection) ou totales (pas d'amplification). L'analyse de témoins d'inhibitions permet de les déceler. La réalisation d'une dilution de l'échantillon pure permet le plus souvent de lever les inhibitions mais augmentation de la limite de détection.
Qu'est-ce qu'une PCR ?
Mise à part dans le cas d'analyse en PCR directe, les analyses sont réalisées via des déclinaisons de la PCR « classique » : amplification de zones au hasard, suivi en temps réel, coupe des fragments, amplification de marqueurs génétiques,...
Chaque PCR nécessite l'utilisation d'amorces (des séquences d'ADN permettant de ciblées la région d'intérêt), d'une polymerase (l'enzyme permettant de copier l'ADN d'origine), de nucléotides (au nombre de 4, ils sont les éléments constitutifs de base de l'ADN), de sels et d'un tampon réactionnel.
Chaque PCR se déroule en 3 étapes :
- La dénaturation : étape consistant à séparer les deux brins complémentaires de l'ADN.
- L'hybridation : étape durant laquelle les amorces s'accrochent à leur ADN spécifique
- L'élongation : étape de copie de l'ADN
L'ensemble de ces 3 étapes constitue un cycle. A chaque cycle la quantité d'ADN copié est doublée. Afin d'obtenir une quantité d'ADN visualisable, nous effectuons des PCR allant de 35 à 40 cycles (selon méthode).
ELISA :
Méthode qualitative et quantitative
Les techniques ELISA actuellement utilisées sont toutes des ELISA sandwich.
L'extraction des protéines totales des échantillons est réalisée de manière spécifique selon l'analyte recherché.
L'analyse ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) repose sur la spécificité de la réaction entre les antigènes et un anticorps dirigés vers les antigènes cibles (fixés au fond de puits). L'ajout d'un deuxième anticorps dirigés vers les antigènes cibles et d'un substrat chromogène permet de révéler et quantifier par photométrie (lecture à 450nm) la présence des analytes cibles.
La quantification requiert l'utilisation d'une gamme étalon spécifique à l'analyte recherché. La concentration en protéine est proportionnelle à l'absorbance.
ISSR-PCR
Méthode uniquement qualitative.
Tous les êtres vivants possèdent dans leur génome de courtes séquences d'ADN composées d'une succession de nucléotide répétée plusieurs fois. Ces séquences répétées sont appelées Short Sequence Repeat (SSR).
L'ISSR (Inter Short Sequence Repeat) PCR consiste à amplifier les zones se situant entre de courtes séquences répétées d'ADN en dirigeant les amorces sur ces SSR. Ces amplifications donnent un profil spécifique de l'échantillon. Les amplifications doivent être visualisées par électrophorèse capillaire.
En comparant les profils de plusieurs échantillons, il est alors possible d'évaluer leur similarité. Sur des échantillons purs (un seul élément dans l'échantillon), il est possible de batir des bases de données sur ces profils permettant d'identifier un échantillon à partir de son profil ISSR.
PCR directe
Méthode qualitative et quantitative.
Cette technique consiste à amplifier de manière spécifique l'ADN de l'élément recherché. Les amplifications doivent être visualisées par électrophorèse capillaire.
La spécificité peut provenir soit des amorces (c'est-à-dire que les amorces ne fonctionneront qu'avec l'élément recherché) soit de la taille de la séquence recherchée (par exemple, deux escargots donnent des bandes de tailles différentes).
Chaque élément recherché nécessite une PCR différente. Ainsi, les conditions pour rechercher du rat sont différentes de celles pour rechercher ou identifier un escargot.
En comparant les profils de plusieurs échantillons, il est possible d'évaluer leur similarité.
La PCR directe couplée à l'électrophorèse capillaire permet également de quantifier les teneurs en ADN des éléments ciblés. Pour ce faire, une gamme de concentrations connues doit être lancée en même temps que les échantillons à quantifier.
RFLP-PCR
Principe :
Méthode uniquement qualitative.
Cette technique consiste à amplifier une zone commune à plusieurs espèces (exemple : amplifier tous les animaux). Cette zone doit présenter des différences d'une espèce à l'autre. L'idée est alors de couper la séquence amplifiée à l'aide d'une enzyme prévue pour reconnaitre spécifiquement cette différence. Les coupes doivent être visualisées par électrophorèse capillaire.
Une même enzyme ne coupera donc pas de la même manière une séquence « Porc » et une séquence « Boeuf », et ne coupera pas du tout une séquence « Poulet ». Pour couper, cette dernière une autre enzyme est nécessaire. L'identification de plusieurs espèces fait donc intervenir plusieurs enzymes.
Il est alors important de noter que chaque enzyme possède son propre couple temps/température pour fonctionner. De fait, la coupe de chaque enzyme intervenant dans l'identification est réalisée de manière indépendante.
qPCR
Principe :
Méthode qualitative et quantitative
Cette technique vise à amplifier de manière très spécifique une zone « unique » d'une espèce donnée. Cette spécificité peut être soit liée uniquement aux amorces, soit nécessité l'utilisation d'une sonde (dans ce cas c'est elle qui apporte la spécificité).L'utilisation uniquement d'amorces ou d'amorces et de sondes représente deux techniques différentes.
A chaque cycle de multiplication de l'ADN, le thermocycleur lit la fluorescence de l'amplification et permet donc de suivre en temps réel la quantité d'ADN multiplié.
L'interprétation nécessite de définir un seuil à partir duquel les courbes d'amplification sont considérées comme positives. Un échantillon croisant le seuil avant la limite de détection (et si défini, avant le cut-off) est considéré comme positif.
Les quantifications des ADN sont des quantifications absolues et nécessitent l'utilisation d'une gamme étalon. Le résultat est lu en termes de nombre de nombre de copies présent dans l'échantillon, pouvant être ramené en % d'ADN.
SSR-PCR
Principe :
Méthode qualitative et quantitative.
Les SSR (Short Sequence Repeats - aussi appelé microsatellites) sont de courtes séquences répétées présentes dans tous les génomes des êtres vivants.
Le nombre de répétitions composant ces SSR peuvent varier d'un individu à l'autre. Ces marqueurs présentent alors des tailles différentes (polymorphisme de taille). Les microsatellites pour un même individu peuvent être monomorphique (le microsatellite est de même taille sur tous les allèles de l'individu), ou polymorphique (il présente alors des tailles différentes sur chacun des allèles).
Lors d'une analyse par SSR-PCR des amorces spécifiques à l'espèce cible sont utilisées pour l'amplification. L'analyse est effectuée sur un set de marqueurs SSR (le nombre dépend des espèces cibles). Les amplicons sont ensuite visualisées par électrophorèse capillaire.
Pour les mélanges de variétés, les tailles et l'aire de chaque pic issu des électrophérogrammes sont mesurées afin de pouvoir identifier et quantifier les espèces présentent après confrontation à une base de données.
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